Un guiño por Gonzalo Cuesta, una tesis doctoral para la ciencia

Ya hace más de un año que mi buen y gran amigo Gonzalo Cuesta nos dejó envueltos en tristeza para emprender un viaje sin retorno. Gonzalo fue un gran investigador especializado en el área de la Microbiología Ambiental y la Biotecnología Microbiana.

Su principal línea de investigación era el aislamiento y caracterización de actinomicetos aislados de suelos y agua, y la búsqueda de nuevos compuestos con actividad biológica producidos por los mismos, pero también investigó activamente en actinomicetos causantes de alteraciones en el proceso de depuración de aguas residuales y otros aspectos de la Microbiología Industrial y Ambiental. Apasionado por la taxonomía bacteriana, era miembro del Grupo Especializado de Taxonomía, Filogenia y Biodiversidad de la SEM y colaboró activamente con personal de la Colección Española de Cultivos Tipo de la Universidad de Valencia (CECT-UVEG). Fue autor de 17 artículos científicos sobre su área de investigación y tenía varios más en preparación. Mantuvo también una estrecha colaboración con el Instituto Universitario de Ingeniería del Agua y Medio Ambiente (IIAMA) de la UPV.

Apasionado por la docencia, fue profesor de diversas asignaturas desde 2008, primero en Licenciaturas y luego en los Grados de Biotecnología, Tecnología de los Alimentos y Enología de la UPV. Colaboró en la elaboración de 14 publicaciones docentes, dirigió 32 Trabajos Final de Carrera y Tesis de Master, y dos Tesis Doctorales. En los últimos años impartió docencia en el Máster de Ingeniería Ambiental, de carácter interuniversitario UVEG/UPV.

Además de buen docente y apasionado investigador, era una persona tranquila y afable a la que no le dolían las horas en el laboratorio y que estaba siempre dispuesto a ayudar en lo que hiciera falta. Reunió una importante colección de actinobacterias entre las que se encontraban varias candidatas a representar nuevas especies.

A continuación podéis disfrutar de su fabulosa tesis doctoral: DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN POR MÉTODOS FENOTÍPICOS Y MOLECULARES DE MYCOLATA FORMADORES DE ESPUMAS EN ESTACIONES DEPURADORAS DE AGUAS RESIDUALES DOMÉSTICAS CON SISTEMAS DE FANGOS ACTIVOS, dirigida por los doctores José Luís Alonso Molina y Yolanda Trigo Moreno, y defendida en Julio de 2004.

 

Resumen


Los actinomicetos nocardioformes que contienen ácidos micólicos (mycolata) pertenecen al suborden Corynebacterineae, orden Actinomycetales. Este grupo de microorganismos contiene especies filamentosas que causan problemas de formación de espumas biológicas
(“foaming”) en plantas de tratamiento de aguas residuales con sistemas de fangos activos. Estas espumas interfieren en el proceso de depuración de aguas residuales, ya que retienen hasta el 40% de los sólidos en suspensión. La presencia de especies patógenas en este grupo de microorganismos implica un riesgo para la salud pública y por lo tanto la
necesidad de detectar estas especies.

Para caracterizar mycolata se han utilizado los sistemas miniaturizados API ZYM, API ID32 C y MicroLog que permiten la realización de muchas pruebas bioquímicas en poco tiempo. Las pruebas bioquímicas obtenidas por los sistemas API en ocasiones no diferencian todas las especies de este grupo. El único sistema miniaturizado que permite diferenciar todas las cepas de referencia es el sistema MicroLog. De todos los caracteres quimiotaxonómicos el más importante es la detección de ácidos micólicos, ya que los mycolata son los únicos que contienen estos compuestos.

Con la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se han caracterizado cepas de Nocardia de referencia, así como aislados de muestras de fango utilizando iniciadores previamente descritos. Para caracterizar especies de Gordonia aisladas de fangos se han diseñado unos iniciadores específicos que amplifican todas las cepas de Gordonia de referencia. Los iniciadores diseñados para Rhodococcus amplifican todas las especies de referencia de este género. La detección de la especie patógena R. equi se realiza con los iniciadores diseñados previamente para esta especie.

Para detectar las principales especies productoras de espumas sin utilizar métodos dependientes del cultivo se ha utilizado la técnica de la hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH). En primer lugar se ha optimizado el método de permeabilización de las células para facilitar el acceso de la sonda al DNA. Se han utilizado dos métodos de permeabilización y se ha medido la intensidad de la señal utilizando la sonda EUB 338, específica para el dominio Bacteria. Aunque con los dos métodos no se han observado diferencias significativas en la señal, el método propuesto por de los Reyes et al. (1998) se considera más adecuado ya que no altera tanto la morfología celular como el propuesto por Carr et al. (2003). Con las sondas Myb-736 y Myc-657, especificas del grupo mycolata, se ha obtenido señal en todas las cepas de referencia previamente permeabilizadas. Con la sonda G.am-205, especifica para Gordonia amarae, se han detectado cepas de esta especie tanto en cultivo puro como en muestras ambientales. Con la técnica de enriquecimiento se ha conseguido aumentar la señal de hibridación.

Abstract


Mycolic-acid containing Actinomycetes (mycolata) belong to the suborder Corynebacterineae within the order Actinomycetales. This group contains filamentous bacteria that produces thick foam or scum in activated wastewater treatment plants. This foam retains up to 40% of the suspended solids affecting the process. Some species of this group are opportunistic human pathogens and there is a need to detect them quickly to avoid that they could become a human health problem.

Several identification systems such as the miniaturized system API ZYM, API ID32 C and MicroLog have been used to characterize mycolata species. Sometimes, biochemistry profiles obtained by API systems cannot be able to distinguish among all the species. However, the MicroLog system is the only one to discriminate at species level. In order to characterize these species this system detects mycolic acids which are only present in mycolata microorganisms.

Nocardia strains have been characterized using primers previously described by other authors with the use of the polimerase chain reaction (PCR). Moreover, Gordonia (which is the genus most frequently associated with foam problems) and Rhodococcus strains isolated from activated sludge have been characterized with primers designed in this work. Besides, the opportunistic pathogen species R. equi have been detected using specific primers.

The output in the isolation of mycolata species has been improved by three decontamination treatments applied to foam samples reducing the fast growth of the microbiota. Three culture media have been selected to isolate the most important genera of mycolata found in foam.

Fluorescent in situ hybridization technique (FISH) has been used to directly detect the main foam-producing species avoiding the tedious and long-time consuming traditional culture methods. Two cell permeabilization methods have been optimized to allow the access of different probes into the target. Initially, the general Bacteria specific probe EUB 338 was used to compare the efficiency of both methods. Although with both methods no
significant differences have been observed, the method proposed by De los Reyes et al. (1998) is considered more suitable than the one proposed by Carr et al. (2003) due to the absent of disturbance of the cell morphology.

Furthermore, specific probes (Myb-736 and Myc-657) were used to detect the mycolata group. Gordonia amarae have been also detected by the use of a species-specific probe G.am-205. With this probe, G. amarae strains have been detected in both pure culture and in environmental samples. It was also observed that enrichment of foam samples increases the hybridization signals.

Reference


Cuesta, G. (2004) DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN POR MÉTODOS FENOTÍPICOS Y MOLECULARES DE MYCOLATA FORMADORES DE ESPUMAS EN ESTACIONES DEPURADORAS DE AGUAS RESIDUALES DOMÉSTICAS CON SISTEMAS DE FANGOS ACTIVOS. Tesis Doctoral Departamento Biotencología: Universitat Politècnica de València.

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